Вирусы. Скорее друзья, чем враги - Карин Меллинг Страница 26

Обратная транскриптаза имеет большое значение не только для репликации ретровирусов и функционирования механизма «копировать и вставить», который действует в наших ДНК-геномах, но еще и в повседневной работе исследовательских лабораторий. Обратная транскриптаза играет важную роль в осуществлении полимеразной цепной реакции, системы амплификации. Эта система напоминает упрощенную репликацию вируса в пробирке, где происходит экспоненциальная амплификация генов. Эта технология стала революционным событием в области диагностики, поскольку до сих пор остается наиболее чувствительным методом выявления нуклеиновых кислот в микроорганизмах, вирусах, бактериях, опухолевых клетках, образцах любых тканей, ископаемых останках, мумиях, шерсти вымерших бизонов и т.д. Можно выявить даже мутации – единичные генетические изменения. Часто во время обычных посещений врача ПЦР проводится в целях диагностики либо мониторинга статуса заболевания или же реакции организма на терапию, поскольку эта реакция чрезвычайно быстро дает результаты. Получить несколько миллиграммов образца вполне возможно, и этого объема достаточно для проведения окрашивания – метод, который позволяет «увидеть» амплифицированную ДНК. Затем амплифицированная ДНК подвергается дополнительному анализу (секвенирование). Возможны варианты: если исходный материал представляет собой РНК, тогда применяется обратная транскриптаза для получения ДНК – так же, как для репликации ретровируса. Количество РНК отражает активность гена, что является информативным показателем, используемым в исследовательских и медицинских целях. Не соответствующая норме экспрессия может служить признаком заболевания. Поэтому важно провести количественную ПЦР с детекцией в реальном времени, и этот аналитический метод используется очень часто. Такой анализ называется «профилирование экспрессии» и проводится для определения активности всех генов клетки. Он характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью: например, в контексте ВИЧ вирусная нагрузка может определяться на очень низком уровне – 20 вирусных копий на 1 мл. Именно это в газетах называется «излечение», однако на самом деле речь идет не о реальном излечении, а о снижении количества вирусов до неопределяемого уровня. За счет использования технологических приемов удается ускорить реакцию и сделать ее более специфической, а термостабильные ферменты, предназначенные для реакции копирования, позволяют осуществлять полностью автоматическую амплификацию. В Йеллоустонском национальном парке такие ферменты обнаружили в гейзере с температурой воды 60 °С, но потом их стали находить во многих других термальных источниках. Говорят, что один ученый, желая получить термостойкие бактерии из такого термального источника для выделения термостабильной ОТ, поскользнулся на краю кратера и в результате потерял ногу. Если это правда, это очень печально. Этот фермент называется Taq-полимеразой, где Taq означает термостойкую бактерию Thermus aquaticus (это не архея).

Этот метод настолько чувствительный, что позволяет амплифицировать нуклеиновые кислоты из столь малого количества, что они могут оказаться «ни при чем» или не связаны с заболеванием – тем не менее! Поэтому сверхчувствительность метода может быть контрпродуктивна, а слепая вера в него – неправомерна и даже опасна. На самом деле мы не знаем, может ли наша иммунная система удалить незначительное число патогенов или даже раковых клеток, чтобы мы никогда не заболели, но это можно выяснить с помощью ПЦР, и это нас беспокоит.

Однако этот метод действительно помог нам найти утечку опасных фрагментов ДНК ВИЧ в одном из ламинарных боксов, которые попали туда из пробирок. А поскольку мы разрабатывали вакцину от ВИЧ на основе ДНК, то оказались вакцинированными ДНК, находившимися в лабораторном воздухе. При помощи ПЦР удалось найти утечку. Есть еще один недавний, более известный пример: с помощью ПЦР удалось идентифицировать английского короля Ричарда III по останкам из могилы, находящейся под парковкой в Лестере, сравнив ДНК этих останков с ДНК ныне здравствующих членов королевской семьи. Для восстановления филогенетических деревьев мамонтов достаточно шерсти, а для реконструкции миграционных путей первых ископаемых гоминидов вполне достаточно небольших костных образцов. Можно даже реконструировать пищу через несколько тысяч лет. Так же как можно обнаружить микроорганизмы в смоге Нью-Дели или Пекина. ПЦР радикально изменила процесс поиска преступников и убийц, и в настоящее время для определения личности достаточно буквально капли биологической жидкости или волоса. Все это стало возможно благодаря ПЦР.